Komplet za PCR v realnem času virusa Monkeypox

1. VzorecZbirka:Vzorec je treba zbrati v sterilne epruvete v skladu

s standardnimi tehničnimi specifikacijami.

2. Priprava reagenta (območje za pripravo reagenta)

Vzemite ven komponente kompleta, jih uravnotežite na sobni temperaturi za uporabo v stanju pripravljenosti.

3. Obdelava vzorcev (območje obdelave vzorcev)

3.1 Ekstrakcija nukleinske kisline

Priporočljivo je vzeti 200 μL tekočih vzorcev, pozitivno kontrolo in negativno kontrolo za ekstrakcijo nukleinske kisline, v skladu z ustreznimi zahtevami in postopki kompletov za ekstrakcijo virusne DNK.

3.2 Raztapljanje liofiliziranega praška in dodajanje šablone

Pripravite liofilizirano predmešanico virusa opičjih koz glede na število vzorcev.En vzorec potrebuje eno epruveto PCR, ki vsebuje liofiliziran prašek predmešanice.Negativno kontrolo in pozitivno kontrolo je treba obravnavati kot dva vzorca.

(1) Dodajte 15 μL raztopine za raztapljanje v vsako epruveto za PCR, ki vsebuje liofiliziran premiks, nato dodajte 5 μL ekstrahiranih vzorcev/negativno kontrolo/pozitivno kontrolo v vsako epruveto za PCR.

(2) Epruvete za PCR tesno pokrijte, epruvete za PCR pretresite z roko, dokler se liofilizirani prašek popolnoma ne raztopi in zmeša, zberite tekočino na dno epruvet za PCR s takojšnjim centrifugiranjem pri nizki hitrosti.

(3) Če za odkrivanje uporabljate običajni instrument za PCR v realnem času, epruvete za PCR neposredno prenesite v območje pomnoževanja;če za detekcijo uporabljate BTK-8, morate izvesti naslednje postopke: prenesite 10 μL tekočine iz epruvete PCR v vdolbino reakcijskega čipa BTK-8.Ena PCR epruveta ustreza eni vdolbinici na čipu.Med pipetiranjem se prepričajte, da je pipeta navpična pod kotom 90 stopinj.Konice pipete z aerosolno pregrado je treba z zmerno silo postaviti na sredino vdolbinice in prenehati potiskati pipeto, ko doseže prvo prestavo (da se izognete mehurčkom).Ko so vdolbinice napolnjene, odstranite membrano reakcijskega čipa, da pokrijete vse vdolbinice, in čip se nato prenese v območje zaznavanja ojačanja.

4. PCR pomnoževanje (območje zaznavanja)

4.1 Epruvete PCR/reakcijski čip vstavite v reakcijsko posodo in nastavite imena vsake reakcijske vdolbinice v ustreznem vrstnem redu.

4.2 Nastavitve detekcijske fluorescence: (1) virus opičjih koz (FAM);(2) Notranji nadzor (CY5).

4.3 Zaženite naslednji ciklični protokol

Protokol ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protokol BTK-8:

5. Analiza rezultatov (glejte uporabniški priročnik instrumenta)

Po reakciji se rezultati samodejno shranijo.Za analizo kliknite »Analiziraj« in instrument bo samodejno interpretiral vrednosti Ct vsakega vzorca v stolpcu z rezultati.Negativni in pozitivni rezultati kontrole morajo biti v skladu z naslednjim "6. Nadzor kakovosti".

6. Kontrola kakovosti

6.1 Negativna kontrola: Ni Ct ali Ct>40 v kanalu FAM, Ct≤40 v kanalu CY5 z normalno krivuljo ojačanja.

6.2 Pozitivna kontrola: Ct≤35 v kanalu FAM z normalno krivuljo pomnoževanja, Ct≤40 v kanalu CY5 z normalno krivuljo pomnoževanja.

6.3 Rezultat je veljaven, če so izpolnjeni vsi zgornji kriteriji.V nasprotnem primeru je rezultat neveljaven.

Razlaga rezultatov

Možni so naslednji rezultati:

OPOMBA: Če se pojavi neveljaven rezultat, je treba vzorec odvzeti in ponovno testirati.